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Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 11652 (2023) Citer cet article

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L’édition du génome CRISPR est un outil puissant pour élucider les fonctions biologiques. Pour modifier le génome comme prévu, il est essentiel de comprendre les différents modes de recombinaison qui peuvent se produire. Dans cette étude, nous rapportons des insertions de vecteurs complexes qui ont été identifiées lors de la génération d'allèles conditionnels par édition CRISPR à l'aide de la jonction d'extrémités médiée par la microhomologie (MMEJ). Le vecteur de ciblage contenait deux séquences loxP et des microhomologies flanquantes de 40 pb. Les régions génomiques correspondant aux séquences loxP ont été clivées avec Cas9 dans des cellules souches embryonnaires de souris. Le dépistage par PCR pour une recombinaison ciblée a révélé une fréquence élevée de bandes d'une taille plus grande que prévu. Le séquençage des nanopores de ces bandes a révélé des insertions de vecteurs complexes médiées non seulement par MMEJ mais également par une jonction d'extrémités non homologues et une recombinaison homologue dans au moins 17 % des clones. Une nouvelle bande est apparue lors de l'amélioration des conditions de la PCR, suggérant la présence d'allèles modifiés involontairement qui échappent au dépistage PCR standard. Cela nous a incité à caractériser la recombinaison de chaque allèle des clones édités sur le génome à l'aide de polymorphismes hétérozygotes mononucléotidiques, conduisant à la confirmation de la présence d'allèles homozygotes. Notre étude indique qu’un contrôle minutieux de la qualité des clones édités sur le génome est nécessaire pour exclure l’insertion complexe, involontaire et ciblée de vecteurs.

Ces dernières années, la technologie de modification du génome a beaucoup progressé avec l’avènement du système CRISPR1. Cependant, il est toujours possible qu’une recombinaison involontaire se produise lors de l’édition du génome CRISPR. Par conséquent, le contrôle de la qualité des clones modifiés par le génome est important pour garantir que la recombinaison prévue dans les clones ne s’accompagne pas d’une recombinaison involontaire. Une recombinaison involontaire peut se produire au site cible de la recombinaison ou dans des régions génomiques éloignées du site cible. Ce dernier type de recombinaison se produit souvent dans des séquences génomiques similaires à la séquence cible en raison de l’hybridation partielle des ARN guides (ARNg). Une telle recombinaison est appelée effets « hors cible » et diverses méthodes ont été développées pour la détecter2,3. En ce qui concerne l'ancienne recombinaison involontaire « sur la cible », des délétions importantes sur le site cible ont été signalées4,5,6,7. Généralement, les recombinants d’intérêt sont criblés par PCR. Par conséquent, les délétions génomiques importantes qui accompagnent la perte des sites de liaison des amorces PCR peuvent passer inaperçues. Récemment, d’autres types de recombinaison involontaire sur cible ont été rapportés dans lesquels des vecteurs d’ARNg ou de l’ADN mitochondrial sont insérés au niveau du site de clivage génomique cible8. Bien que les sites de liaison des amorces PCR aient été préservés dans ces cas, l’insertion de la séquence exogène involontaire est passée inaperçue lors du dépistage initial par PCR car la taille de l’amplicon PCR était supérieure à la limite de détection. Une telle recombinaison involontaire sur la cible doit être soigneusement examinée, en particulier lorsqu'une édition biallélique du génome est envisagée, car la perte de l'allèle de type sauvage (wt), vérifiée par analyse PCR, peut être causée non pas par une édition homozygote du génome mais par la combinaison de l'allèle de type sauvage (wt). recombinaison dans un allèle et recombinaison involontaire dans l’autre allèle.

Dans la présente étude, nous rapportons des modèles d'insertion de vecteurs involontaires, complexes et ciblés que nous avons identifiés lors du processus de génération d'allèles conditionnels pour le système Cre/loxP dans des cellules en culture. Pour générer un allèle conditionnel, deux séquences loxP doivent être insérées, l’une en amont et l’autre en aval de la région génomique cible. De plus, pour effectuer une analyse phénotypique dans des cellules en culture, les deux allèles doivent être modifiés de la même manière. Ainsi, un total de quatre sites loxP doivent être insérés dans le génome. Différentes voies de réparation, c'est-à-dire la recombinaison homologue (HR), la jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) et la jonction d'extrémités médiée par la microhomologie (MMEJ), peuvent être utilisées pour introduire des séquences étrangères dans le génome. HR est la voie la plus largement utilisée et nécessite un bras d'homologie de 500 à 1 000 pb dans le vecteur de ciblage9. La voie HR serait active principalement de la fin de la phase S à la phase G2 du cycle cellulaire10. En revanche, la voie NHEJ est active tout au long du cycle cellulaire10. Par conséquent, la méthode basée sur NHEJ permet une insertion ciblée dans les types de cellules dans lesquels la méthode HR est inefficace, comme les neurones, bien que la séquence de jonction au niveau du site de recombinaison soit difficile à contrôler par rapport à celle de HR11. Plus récemment, une méthode appelée système PITCh (Precise Integration into Target Chromosome) utilisant MMEJ a été développée12,13. Cette méthode utilise des bras de microhomologie aussi courts que 10 à 40 bases pour la recombinaison. La voie MMEJ serait active principalement de la phase M au début de la phase S14, permettant un mode de recombinaison différent de celui de la HR. Nous avons utilisé la méthode PITCh dans la présente étude car l'insertion de la séquence loxP de 34 bases dans le génome peut être facilement détectée par PCR en raison de la courte longueur du bras d'homologie du vecteur de ciblage. Cependant, le dépistage par PCR a révélé des bandes de tailles involontaires, plus longues que prévu, à une fréquence élevée. L'analyse de ces bandes avec le séquençage à lecture longue Nanopore a révélé des insertions de vecteurs complexes impliquant non seulement MMEJ mais également HR et NHEJ. La taille de la séquence du vecteur inséré pourrait dépasser la limite de détection de la méthode standard de contrôle de qualité basée sur la PCR pour les clones édités sur le génome. Nous proposons que la recombinaison involontaire sur la cible détectée dans cette étude doive être soigneusement exclue lors de l'étape de contrôle qualité de l'édition du génome.