Détection spécifique de l'activité d'ensemencement de la protéine Tau dans la maladie d'Alzheimer à l'aide de cellules biocaptrices conçues de manière rationnelle

Neurodégénérescence moléculaire volume 18, Numéro d'article : 53 (2023) Citer cet article

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La propagation de la protéine tau de type prion dans les troubles neurodégénératifs implique que la protéine tau pathologique mal repliée peut recruter la protéine normale et modèler son agrégation. Nous rapportons ici les méthodes de développement de lignées cellulaires de biocapteurs sensibles pour la détection de l’activité d’ensemencement de tau.

Nous avons réalisé la conception rationnelle de nouvelles sondes tau sur la base des connaissances structurelles actuelles des agrégats pathologiques de tau dans la maladie d'Alzheimer. Nous avons généré des lignées cellulaires stables de biocapteurs basées sur le transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) et caractérisé leur sensibilité, leur spécificité et leur capacité globale à détecter la protéine tau bioactive dans des échantillons humains. Par rapport à la gamme de biocapteurs de référence, la conception optimisée de la sonde a entraîné une efficacité accrue dans la détection de l’ensemencement de tau. La sensibilité accrue a permis la détection d'une quantité plus faible de compétences d'ensemencement de tau dans des échantillons de cerveau humain, tout en préservant la spécificité des graines de tau trouvées dans la maladie d'Alzheimer.

Cette nouvelle génération de cellules biocaptrices basées sur FRET constitue un nouvel outil pour étudier l'activité d'ensemencement de la protéine Tau dans des échantillons humains atteints de la maladie d'Alzheimer, en particulier dans les échantillons présentant de faibles niveaux d'activité d'ensemencement, ce qui pourrait faciliter l'étude des événements pathologiques précoces liés à la protéine Tau.

L'accumulation cérébrale de la protéine tau associée aux microtubules (MAPT) en agrégats insolubles est une caractéristique neuropathologique majeure de la maladie d'Alzheimer (MA) et d'autres troubles neurodégénératifs appelés tauopathies. Tau est une protéine intrinsèquement désordonnée, normalement présente dans le compartiment axonal des neurones où elle joue un rôle dans la stabilisation des microtubules. Dans la MA, les formes hyperphosphorylées de tau s'accumulent dans le cytoplasme et s'agrègent en filaments hélicoïdaux appariés (PHF) qui sont des structures filamenteuses en feuille bêta-plissée [1, 2]. La classification stéréotypée de Braak de la pathologie tau de la MA, depuis le cortex entorhinal jusqu'à l'hippocampe, et plus tard jusqu'aux régions limbiques [3], est en corrélation avec la perte de neurones et l'évolution des symptômes cliniques [4,5,6,7,8]. La propagation des agrégats de tau à travers des régions anatomiques interconnectées est étayée par de nombreuses preuves. Par exemple, les animaux transgéniques surexprimant le tau mutant P301L dans la couche II du cortex entorhinal développent des agrégats de tau humain dans le gyrus denté, modélisant ainsi le tau endogène de souris (9). La capacité des agrégats de tau mal repliés à recruter des tau normaux selon un mécanisme « de type prion » est appelée ensemencement et a été reproduite dans de nombreux modèles expérimentaux (10, 11, 12, 13). Le rôle de l'ensemencement dans la propagation de la pathologie humaine est soutenu par la détection de tau compétent pour l'ensemencement (également appelé tau bioactif) dans les régions du cerveau contenant une pathologie manifeste d'enchevêtrement neurofibrillaire, mais également dans des régions ultérieures exemptes de changements pathologiques manifestes. plus loin le long du sentier Braak [14]. La propension à l'ensemencement de Tau dans les cerveaux post-mortem est en corrélation avec le taux de progression clinique, confirmant le rôle fondamental de ce phénomène dans la MA (15, 16).

L’étude des mécanismes d’ensemencement dans la pathologie de la MA a été grandement accélérée par le développement d’une lignée cellulaire de biocapteurs tau basée sur le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) [12]. Cette lignée cellulaire stable de rein embryonnaire humain (HEK 293 T) exprime des sondes qui sont un mutant pro-agrégateur P301S du domaine répété tau 4R (RD, acides aminés 244 à 372) fusionné soit à une protéine fluorescente cyan (CFP), soit à une protéine fluorescente jaune. (YFP). L’ajout de matériel tau compétent pour l’ensemencement dérivé du cerveau AD ou de fibrilles tau préformées induit l’agrégation de ces sondes fluorescentes et le signal FRET ultérieur. Le signal FRET peut être quantifié par cytométrie en flux 24 h après incubation avec des graines de tau. Pour augmenter la sensibilité de la détection des graines, les liposomes sont mélangés avec du matériel compétent pour l'ensemencement pour transduire les graines dans les cellules (17). En l'absence de liposomes, les cellules biocapteurs peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes d'absorption des graines [18, 19]. Les cellules de biocapteurs Tau ont été utilisées pour amplifier et quantifier spécifiquement des quantités infimes de tau bioactif provenant de divers échantillons de MA, y compris des extraits de cerveau en utilisant diverses méthodes de purification, du liquide céphalo-rachidien (LCR) post-mortem, du LCR lombaire antemortem ou des vésicules extracellulaires dérivées du cerveau (20,21,22). ,23,24].